centrodiagnosticocardiovascolare.it

  

Bästa artiklarna:

  
Main / Hur man löser sig över torkad DNA

Hur man löser sig över torkad DNA

Salt för att neutralisera laddningen på nukleinsyran. Detta gör att DNA blir mindre hydrofilt och fäller ut ur lösningen. Is för att kyla provet. Lägre temperaturer främjar flockuleringen av nukleinsyrorna så att de bildar större komplex som pelleterar under centrifugalkrafterna hos en mikrocentrifug. En nukleinsyrakoncentration som är tillräckligt hög för att tvinga DNA: n ur lösningen om koncentrationen inte är tillräckligt hög, kan du lägga till en bärarnukleinsyra eller glykogen för att förbättra återhämtningen.

Nackdelen är dock att salt också kommer att fällas ut i isopropanol. Med etanol måste DNA ha en högre koncentration för att flockulera men saltet tenderar att förbli lösligt, även vid kallare temperaturer. Så för det typiska utfällningsprotokollet tillsätts isopropanol från mellan 0. Om du fäller ut små volymer DNA och du kan passa den nödvändiga mängden lösningsmedel i provröret, är iskall etanol det föredragna valet. Eftersom mindre isopropanol behövs för utfällning kan du ofta passa ditt prov och lösningsmedlet i ett 15 ml rör.

Eftersom DNA är mindre lösligt i isopropanol tillåter isopropanol utfällning av större arter och lägre koncentrationer av nukleinsyror än etanol, speciellt om du inkuberar vid låga temperaturer under långa tidsperioder. Så nu vet du skillnaden mellan etanol och isopropanolutfällning och när man ska använda varje metod.

Lycka till med dina DNA-utfällningar! Tack för denna tydliga förklaring. Det hjälper mycket de studenter som upptäcker molekylärbiologins vackra värld! Använde du för mycket natriumacetat?

Om så är fallet kan du bara öka volymerna proportionellt för resten av nederbörden. Kom bara ihåg att din återhämtning kan vara lite lägre. Jag skulle vara tacksam om du kan förklara hur detta protokoll fungerar: Gjorde detta i en sats om sex och ingen av dem puttade ut med en tråd, blev bara grumlig och behövde centrifugering ....

Är mina lösningar avstängda? Med Qiagen puregene kit finns det i grunden lyseringsbuffert, protein ppy soln, och isp ... .. Det är det. Jag hade en fråga om att frysa provet över natten när etanolen hade tillsatts. Några idéer om detta?

Använd bara ett zymokit för att koncentrera och rengöra dna på cirka 15 minuter, fungerar bra, vi använder det för att rengöra genomiska dna-prover som bara har massor av föroreningar i sig av naturen ... Det vill säga formalinfixerade, fostervätskor etc. ... Det kan vara till nytta om du gör mycket kloning, inget behov av DNA-förberedelse varje vecka.

Protokollet säger över natten men kan jag lämna det en helg eller länge? Tack! Vi använde dock jordgubbar. Ju högre andel alkohol desto bättre. Annars kan du använda de saker du hittar i en apotek. Se bara till att det är iskallt.

Låt mig veta om du behöver ett protokoll. Baserat på min observation verkar Isopropanol fungera bättre än alkohol, men de gjorde ingen signifikant skillnad förutom att det tog kortare tid att se att nederbörden inträffade. Jag extraherade DNA från växten, M. Jag har också bra OD-resultat. Jag har fint band i gel efter standard PCR. Ingen signal syns dock i realtid.

Jag använder DNA-mängd som sträcker sig från 100ng till 1ng med primer 100nM. Jag ändrade DNA- och primerkoncentrationer många gånger. Det är svårt att lösa problemet. Det skulle ge dig en uppfattning om något är fel med din polymeras eller annan reaktionskomponent. Jag undrar om det finns en skillnad mellan -20C inkubation v -70C inkubation annat än skillnader i tider? Är man en mer effektiv metod för att använda etanolutfällning för DNA-koncentration? Enligt min erfarenhet fick jag ingen skillnad i utbyte mellan de två olika temperaturerna.

Jag har en fråga. Skulle etanolutfällningen skada dessa amplikoner med tanke på att de är relativt stora. Tack så mycket för din hjälp! Jag förstod att centrifugeringen behövde göras vid 4C. Men vad kommer att hända om jag gjorde isopropanolcentrifugering under 1 timme, men centrifugen startades vid 31 ° C och kyldes ned till 4 ° C under centrifugeringen med provet. Så det tog cirka 30 minuter att svalna till 4C med provet inuti och än de återstående 30min arbetade centrifuren vid 4C.

Kan det påverka DNA-kvaliteten eller bara kvantiteten? Får du bättre resultat med kyld etanol än med rumstemperatur? Tack så mycket för det här användbara inlägget. Jag skulle vilja veta om: Vilka reagens rekommenderas i så fall? Nedströms bearbetning av prover är för NGS prep, varav en del involverar enzymklyvningar. Först och främst tack för den här informationen, det är verkligen användbart. Jag har problem med förhållandet 230-260, vanligtvis får jag värden nära 1 eller lägre, istället för 2, men jag kan inte räkna ut vad jag gör fel.

Den senare absorberas vid både 270 nm och 230 nm, så om du har överföringsförorening som kommer att få din renhet att sjunka. GITC absorberar vid 260 nm. Hej allihopa. Tack för det fina inlägget om skillnaderna kring preciptating DNA och RNa i isopropanol och etanol. Jag har en fråga om molnet som uppträder efter tillsats av isopropanol i rna extractio.

Det är rna? Och de konstiga filamenten som förändrar ljusbrytningen? En annan användbar hjälp som jag skulle vilja få från er är varför ibland min rna inte preciptaterar i botten efter centrifugering. Det är så frustrerande. Jag gör extraktioner från hjärtat av möss och jag borde få minst 100-300 ug, men jag får bara 20-60.

Thnx väldigt mycket. Hej Tiago, tack för din fråga. Jag skulle säga, ja, exakt, om du ser filament falla ur lösningen, borde det vara nukleinsyrorna. När det händer är avkastningen hög. Ofta ser du det inte så, men jag ser ibland opakhet bildas och sedan försvinner det.

Från hjärtmuskeln bör du inte få andra föroreningar som polysackarider som bildar och orsakar nederbörd. Vilken metod använder du för extraktion av RNA? Hjärtat är en svår provtyp eftersom det är en fibrös vävnad. Hur mycket vävnad börjar du med? Berätta mer om metoden du använder för RNA-isolering och vi kan ta reda på vart den ska. När du centrifugerar för att pelletera RNA, snurra i 20-30 minuter med full hastighet 16.000 x g eller högre.

Vilken tid och hastighet använder du? Bäst, Suzanne. Vad ska jag göra för att få rent DNA för fingeravtryck. Det här är verkligen användbar information, tack! Mitt laboratorium har dock inte temperaturkontrollerade centrifuger, och de värmer upp proverna ganska mycket efter bara 10 minuter i full hastighet. Jag undrar om fördelarna med en 20 eller 30 minuters centrifugering kan motverkas av att proverna värms upp? Är det troligt att en del av DNA resuspenderas?

Andra prover ger en topp vid 265 - 269 nm, och fortfarande andra skulle inte ha någon topp alls. Några av de pellets som jag får skulle vara brunfärgade. Har du några förslag på detta resultat? Jag har en grundläggande tvivel. Om det är sant överskattas kvantifieringen av cDNA med Nanodrop, eller hur? Det enda skälet att städa upp RT-reaktionen är att kvantifiera den först.

Det enklaste sättet att städa upp RT är att använda en kommersiell PCR-saneringskit eller att använda fenol-kloroform först och sedan fälla ut. Så det är bättre att ta bort det före nederbörd för att vara säker. Hej D, jag har hört detta från andra förut men aldrig upplevt det. Gör du en fenolextraktion och kanske överfördes en del av den organiska fasen till det vattenhaltiga?

(с) 2019 centrodiagnosticocardiovascolare.it